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RNA提取关键是建立一个无RNase的实验环境

RNA提取过程的关键是建立一个无RNase的实验环境,因此在整个过程中要防止RNase的污染。应注意以下几点:

1、液氮

  由于提取RNA需要活体组织,而在大批量提取RNA时就需要液氮固定RNA,以赢取保存时间。

  使用液氮应注意:

1)、准备冻存管、冻存盒放置需液氮中保存的样品。

2)、液氮中有三个取液氮容器,不宜直接将冻存管放于液氮罐中,这样会使冻存管漂浮起来。固可用纱布、棉线将取氮容器口封住,保存样品。

3)、取样品时,需要使用研钵。研钵在使用前,需清洗,并用纯酒精灼烧以充分灭菌。在研磨液氮保存的样品时,需加入液氮,迅速研磨,待组织变软,再加少量液氮,再研磨。如此三次。可用消毒过的钥匙将研钵中的组织样品转入EP管中。介于所取的样品不能完全转移到EP管中,故而在取样时需多取样品,以免不够。

4)、新买的液氮罐需用一定液氮进行清洗与预冷。固相对于10液氮罐第一次需定15升液氮。液氮可有效保存样品半个月。

2、无RNase实验条件的建立

1)       用盛有70%酒精的喷壶清理实验台、超净工作台、低温离心机及操作范围内所有区域以保证没有污染,在实验过程中也需要不断的用70%酒精清理。

2)       实验过程中所用的剪刀、镊子、研磨棒等需要高温灭菌,并在烘箱中高温烘烤6小时以上。紫外灯照射。

3)       实验所用的一次性枪头、大小EP管、研磨棒、需要现用现灭。

4)       配带一次性口罩,尽量避免说话。

5)       取液器是RNase的一个重要污染源,一般采用酒精擦洗取液器的内部和外部。

6)       操作过程中保证强风,操作间隙需不断进行紫外灭菌。

3、快速提取RNA注意事项

1)、用液氮瞬间冻结样品。值得特别注意的是:组织块必须保证足够小,在浸入液氮的瞬间就能冻结,以确保瞬间令RNA酶失活。

2)、提取RNA中所用的75%乙醇、氯仿、异丙醇、枪头、EP管需提前预冷。低温离心机需提前打开四度预冷。

3)、低温离心机只有12个孔,故而每次只能提取12管的样品,切勿多取。

4)、预先将实验所用的EP管进行标号预冷,再紫外照射。

5)、提取好的RNA要求为室温静置一个小时以保证充分溶解,但事实上一般都在冰盒或四度溶解20分钟,以避免RNA讲解。

6)、反转录过程中需提前计算MIX所需各个试剂的用量,MIX可比所需用量多配两管甚至多管,在分装时不宜完全按下枪以保证足够用量。

7)、RNA inhibitorM-MLV 如若看似不够,需稍稍离心后再操作。

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