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液氮罐细胞冷冻原理

  实验原理

  细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196~C液氮中低温保存,可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来,这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞,可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种,起到了细胞保种的作用。除此之外,还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。 细胞冻存时向培养基中加入保护剂——终浓度5%~15%的甘油或二甲基亚砜(DMSO),可使溶液冰点降低,加之在缓慢冻结条件下,细胞内水分透出,减少了冰晶形成,从而避免细胞损伤。标准冷冻速度开始为-1 到 -2℃/min,当温度低于-25℃时可加速,到-80℃之后可直接投入液氮内(-196℃)。

  目前常用的保护剂为二甲亚砜(DMSO)和甘油,它们对细胞无毒性,分子量小,溶解度大,易穿透细胞。

  实验材料

  仪器:液氮罐、冻存管(塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶)、离心管、吸管、离心机等

  试剂:0.25%胰酶、培养基、含保护剂的培养基(即冻存液)

  附:冻存液配制:培养基加入甘油或DSMO,使其终浓度达5-20%。保护剂的种类和用量视不同细胞而不同。配好后4℃下保存。

  实验步骤

  1.消化细胞,将细胞悬液收集至离心管中。

  2.1000rpm离心10分钟,弃上清液。

  3.沉淀加含保护液的培养,计数,调整至5×106/ml左右。

  4.将悬液分至冻存管中,每管1ml。

  5.将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口,封口一定要严,否则复苏时易出现爆裂。

  6.贴上标签,写明细胞种类,冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。

  7.按下列顺序降温:室温→4℃(20分钟)→冰箱冷冻室(30分钟)→低温冰箱(-30℃ 1小时)→气态氮(30分钟)→液氮。

  注意:操作时应小心,以免液氮冻伤。液氮定期检查,随时补充,绝对不能挥发干净,一般30立升的液氮能用1~1.5月。

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